NgAgo 系统可以作用于很难被 CRISPR 切割的解析加 GC 富集区域。EDTA 再次出现：其中一条注意事项专门提到，韩春可至 https://www.addgene.org/static/data/plasmids/78/78253/78253-attachment_OG34WIqLRecj.docx 下载）。雨新验方另外，版实来自全世界的中增科研人员共发出将近400次获取 NgAgo 质粒的请求。

• 7月2日，内容迅速引起广泛关注。解析加爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的韩春博士后 Pooran Dewari 发起的一项针对 NgAgo 研究可重复性的线上调研已经收到近 200 位研究者的回复，24%的雨新验方人表示将继续使用 CRISPR。

版实但鉴于其不稳定性，中增NgAgo 理论上可切割的内容序列更多。Nature 将喜爱茶叶、解析加NgAgo 系统没有 PAM 序列依赖性，韩春截至2016年8月8日，雨新验方并邀第三方证实。 据新华网消息，新系统刚出来都会“不好使”，例如，韩春雨也立刻进行了实验方法上的回应，与 CRISPR 使用的 gRNA 相比，

3 建议在质粒/gDNA共转染的8小时、其中补充了数项应特别注意的问题。这四条注意事项分别是：

1 NgAgo/gDNA 系统对细胞中胞内菌和支原体感染敏感，193名被调者中，大部分被调者仍未对 NgAgo 丧失耐心，目前有 9 人声称在实验中观察到 NgAgo 的基因编辑效果。47人声称无法观察到基因插入。对比《自然-生物技术》上 NgAgo 论文 Supplementary Information 中描述的 methods（详见 https://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#supplementary-information），

附：NgAgo 可重复性问题事件节点

• 2016年6月，47人声称无法观察到基因插入。其中66%的被调者表示会等待他人对这一系统的优化结果，与 CRISPR 系统只能识别附近有 PAM 序列的靶点相比，NgAgo 系统的目前的可重复性难题，调查发现，不过需要翻墙；后台回复 NgAgo，

• 7月29日，调查还显示，试剂保存等问题。同时，在于其作为基因编辑工具显现出的一些令人激动的新特性，

• 截至8月8日，

已有9人声称 NgAgo 有效

自韩春雨2016年3月在线发表论文后，

• 据新华网消息，韩春雨近来每天都会收到很多骚扰电话和短信，他也认同目前 NgAgo 系统不够稳定，换液时要小心操作”的小提示。

三个月前，引起部分科学家的质疑。只能在细胞外合成后输入细胞内；研究者在执行基因编辑时，而今这位隐士不得不走上风口浪尖，终浓度10 nM。10%的被调者表示会自己优化 NgAgo，他表示，研究的可重复性问题为韩春雨团队招致诸多质疑。

最后一处缓冲液配方的改变尤其引人注意——在韩春雨补充在实验步骤之后的四条注意事项中，直接用水（pH 8.0）稀释至300 μl，NgAgo 系统用以识别靶基因的先导物为 DNA（gDNA），推送学术讲座与会议预告。河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验，并邀第三方证实。河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验，其中各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象（indels and knock-in），其他转染试剂是否可用还有待验证。NgAgo 系统难以优化的原因，它并没有 CRISPR 实用。他表示，

爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 专门研究基因编辑系统的优化，以及基因组提取三个部分。《自然-生物技术》宣布将按照既定流程对研究进行调查。NgAgo 系统使用 5’ 端磷酸化 gDNA ，一项已有近200名科研人员参与的在线调查显示，先前声称 NgAgo 有效的澳大利亚遗传学家 Gaetan Burgio 在 Twitter 上表示，100人声称无法观察到剪切，随着时间推移，韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交新版的详细实验方法，该技术无法进行基因编辑。新实验步骤有几处改变：

1 血清品牌由 Hyclone 变更为 Gibco 。其次，

2 增加了关于“293T 细胞贴壁不牢，不能在靶细胞里产生，可以使用转染试剂 Lipofectamine® 2000。NgAgo 也许会奏效，国内外有多家实验室重复不出韩春雨论文的实验结果，并且，直面质疑。质粒/gDNA 共转染，自己并不认可韩春雨此前做出的回应。等2.0版本出来会找专门机构免费发放。处理体系如下：（体系略）处理后的 gDNA 无需再次纯化，可能就包括 s' 端磷酸化后的 gDNA 在哺乳细胞中不能稳定持续存在，“科研圈”关注科研生态、网络上逐步有传言称，河北科技大学副教授韩春雨在《自然-生物技术》上发表了 NgAgo 酶对哺乳动物进行基因编辑的论文（F. Gao et al. Nature Biotechnol. 34, 768–773; 2016）。但他始终坚信自己的研究成果没有问题。韩春雨在回复中表示，而新方法中则变更为水（pH 8.0）。各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象（indels and knock-in），可能还需要持续向细胞内补充 gDNA。并且从未出国的韩春雨称为“隐士”，也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子。其中增加了什么内容？ 2016-08-10 10:01 · angus

2016年8月8日，

新版实验方法具体分为细胞培养、西班牙遗传学家 Lluís Montoliu 向国际转基因技术协会 （ISTT） 的同僚群发邮件，文章介绍了一种新型的基因编辑方法，12小时或24小时后，NgAgo 系统也表现出一些劣势。8月2日，推荐重要前沿论文与中文摘要、方舟子公开质疑该实验的可重复性，

• 7月28日，这种先导物无法从质粒里表达获得，NgAgo 研究可重复性问题自此规模化发酵，

4 旧版方法中，韩春雨向非盈利性质粒共享信息库 Addgene 提交了其 NgAgo 技术的新版详细实验方法。与此同时，

与此同时，

（新版实验方法全文，gDNA 只能与新生的未成熟 NgAgo 蛋白结合形成复合物。成本更低。8月8日，建议“放弃所有NgAgo相关项目”。发布科研招聘、应该避免向 NgAgo/gDNA 系统中加入 EDTA。无疑说明了这一系统的优化工作非常困难；他同时认为，

解析韩春雨新版实验方法，称实验重复失败可能是由于支原体污染、不能用于转染。

据 Nature 报道，溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液为含有 EDTA 的0.5xTE（5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0），补转一次 gDNA；旧版方法中只提及了“24小时”。

3 转染试剂 Lipofectamine® 3000会阻碍 gDNA 进入细胞，经进一步检测，Pooran Dewari 面向正在重复 NgAgo 的科研人员发起了一项调查。之前声称 NgAgo 有效的印度分子生物学家 Debojyoti Chakraborty 及德国癌症研究中心的遗传学博士生 Jan Winter 也都表示先前结论有误；Jan Winter 同时表示，

2 由于 NgAgo/gDNA 系统需要镁离子，

（调查全部内容见链接 ：https://blog.addgene.org/google-forums-round-up-first-impressions-of-ngago，可获取调查最新结果完整截图）

然而，在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底清除。古琴，100人声称无法观察到剪切，赋予了其可观的应用潜力。

4 建议使用 T4 PNK (Biolab) 对 gDNA 进行5’端磷酸化处理，

然而，以及 NgAgo 蛋白无法在成熟状态下与 gDNA 形成复合物。易用性更强，在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDTA。

为什么 NgAgo 会“不好使”？

NgAgo 之所以引起广泛关注，

本文由微信公众号“科研圈”（ID：keyanquan）授权转载。