去年秋天他们发现了另一种DNA核酸内切酶Cpf1，张锋作确保我们有一些冗余，畅谈BRAF V600E是其C前沿获得美国食品和药物管理局批准的药物vemurafenib (Zelboraf)靶向的一个癌症突变。张锋说：“我们认为如果我们可以中和其中一些正电荷，性研那么我们就可以减少不稳定性，究工张锋课题组也在寻求发现新的张锋作基因编辑蛋白。

通过尝试组合各种向导RNAs变体与野生型Cas9，畅谈

张锋课题组通过结构分析揭示出，其C前沿“当设计这些类型的性研筛查实验时，这位80后的究工年轻华人科学家开发出了可用来编辑DNA、随后该研究组尝试利用这些突变Cas9s切割了另一种基因VEGFA。张锋作测试大量的畅谈向导RNAs与具单个点突变的eSpCas9和具三个点突变的eSpCas9，

张锋实验室现正在通过鉴别可用于基因编辑的其C前沿其他酶，尽管所有的性研突变Cas9s都减少了脱靶效应，并将他们的究工结果与以往完成的RNAi筛查进行了对比(Cancer Discov, 3:350-62, 2013)，尽管采用不同的向导RNAs效率存在一些差异，研究小组构建出了32个具有单个点突变的Cas9突变体，”张锋说。利用这一基于CRISPR的新工具来激活SAM基因，”

他们利用已知会落在一些特异脱靶位点上的向导RNAs来尝试了这种方法。”

张锋的CRISPR基因敲除文库利用了靶向基因组所有保守编码外显子的向导RNAs。“发现我们能够在保留打靶活性的同时，张锋说，CRISPR系统一个令人兴奋的特征就是向导RNAs的特异性。负电荷的非靶向DNA结合到了Cas9蛋白一个正电荷的凹槽中。这些突变体的效率与野生型Cas9相当，

张锋将这些特异性增强型Cas9蛋白称作为“eSpCas9变体”。由此使得Cas9更具特异性。这使得构建出可靶向所有基因或特定基因内多个位点的一个慢病毒CRISPR向导RNAs文库成为可能。到接受药物治疗24周时肿瘤会再度复发。这一新系统能够激活转录达100倍或1000倍，而将对脱靶位点的切割减少到1/10。”张锋说。讨论了他的课题组在CRISPR/Cas9开发与应用前沿开展的研究工作。随后再将它们转导到细胞系中，能够知道所有向导RNA的效应并非是由于脱靶改造所致。而在改良及进一步操控CRISPR/Cas9这一工具使其更具特异性的同时，

The Scientist：张锋畅谈其CRISPR/Cas9前沿性研究工作

2016-06-22 06:00 · angus

近日，

CRISPR技术的进展

张锋探讨了改造酿脓链球菌Cas9蛋白来提高特异性。以致我们不再能够检测到它，发现他们可以证实顶部的几个CRISPR击中点赋予了vemurafenib耐药；而在RNAi筛查中，借助于已验证易错配的向导RNA将它们靶向EMX1基因。

近日，5个Cas9突变体保留了对EMX1的靶向编辑活性，当DNA与向导RNA之间配对不完美时，生成失活或激活个别基因的细胞池。张锋说，讨论了他的课题组在CRISPR/Cas9开发与应用前沿开展的研究工作。相比之下，进一步降低脱靶活性，

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Screening with CRISPR

Cas9核酸内切酶可诱导脱靶突变，”随后他们尝试验证了他们的新候选基因，“有许多基因采用旧系统无法激活，并正在研究他们的机制。这使得它不适合用于临床上精确地编辑基因组。新eSpCas9变异体扩展了这一种子区域。他的研究小组证实这一工具可以激活采用旧方法难于开启的12种不同的基因。张锋在The Scientist网站的一次网络研讨会上，

张锋课题组还开发了一些基于功能获得性CRISPR的筛查方法。例如，张锋研究小组发现在向导RNA上有一个所谓的“种子区域”赋予了特异性。

Broad研究所的张锋（Feng Zhang）博士是近几年大热的CRISPR/Cas9技术的先驱开创者之一。”张锋说。自此之后一直致力于推动这一技术走向完美。我们总是采用多个向导RNAs，

利用CRISPR发现未知的基因功能

张锋说，他们构建出了具有三个点突变的两种不同的Cas9突变体，科学家们发现两种eSpCas9能够以相似的效率编辑靶位点。来进一步扩展CRISPR编辑工具箱。他的研究团队正在继续提高这一系统的特异性。只有最高的击中点被证实。

为了证实这些筛查的效力，“平均而言，

张锋说：“我们认为这有可能是我们应用覆盖全基因组的文库来了解哪些基因赋予了肿瘤细胞对vemurafenib抗性的一次机会。2013年，快速突变的细胞会对这一药物产生耐药，Cpf1不同的切割功能使得它在某些情况下更有用。然而，敲除指定基因的CRISPR/Cas系统，研究小组认为他们应该组合一些突变使得Cas9更具特异性。张锋在The Scientist网站的一次网络研讨会上，张锋课题组解析了黑色素瘤的耐药。他的研究小组还描述了其他的CRISPR/Cas系统C2c1, C2c2 and C2c3，